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半連續(xù)發(fā)酵在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用

菌體濃度是發(fā)酵控制的關(guān)鍵參數(shù)，以下我們通過菌體濃度及菌體形態(tài)對(duì)發(fā)酵罐發(fā)酵的影響及控制進(jìn)行分別闡述。
菌體濃度的影響及控制
菌體濃度的大小，在一定條件下，不僅反映菌體細(xì)胞的多少，而且反映菌體細(xì)胞生理特性不完全相同的分化階段。
在發(fā)酵過程中，菌體濃度的大小與菌體的生長(zhǎng)速率密切相關(guān)，而生長(zhǎng)速率又與微生物的種類、遺傳特性、培養(yǎng)基及環(huán)境條件有關(guān)。
菌體濃度是單位體積培養(yǎng)液中菌體的含量。無論在科學(xué)研究上，還是工業(yè)發(fā)酵控制上，它都是一個(gè)重要的參數(shù)。
1. 菌體濃度的影響
主要體現(xiàn)在影響產(chǎn)物產(chǎn)率和發(fā)酵液溶氧兩方面。
在適當(dāng)?shù)谋壬�長(zhǎng)速率下，發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)率與菌體濃度成正比關(guān)系。
但菌體濃度過高，會(huì)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生多種不利影響，可能改變菌體的代謝途徑，特別是對(duì)培養(yǎng)液中溶氧的影響較明顯。
為獲得羅高的生產(chǎn)率，需要采用攝氧速率與傳氧速率相平衡的菌體濃度，最好維持在臨界菌體濃度。
在抗生素生產(chǎn)中，如何確定并維持臨界菌體濃度是提高抗生素生產(chǎn)能力的關(guān)鍵。
發(fā)酵過程中隨著菌體濃度的增加，培養(yǎng)液的攝氧率按比例增加，但表觀黏度也增加，使氧的傳質(zhì)速率減少，當(dāng)攝氧速率大于供氧速率時(shí)，發(fā)酵液溶氧濃度就會(huì)減少，并成為限制性因素。
比如，早期酵母發(fā)酵，出現(xiàn)過代謝途徑改變、酵母生長(zhǎng)停滯、產(chǎn)生乙醇的現(xiàn)象；抗生素發(fā)酵中，也受溶氧限制，使產(chǎn)量變低。
2. 菌體濃度的控制
菌體濃度的大小與菌體生長(zhǎng)速率有密切關(guān)系，而菌體生長(zhǎng)速率與環(huán)境條件和自身遺傳因素有關(guān)，在這些影響因素中，通過改變培養(yǎng)基濃度及中間補(bǔ)料來控制菌體濃度是發(fā)酵過程中主要的措施。
首先確定基礎(chǔ)培養(yǎng)基中有適當(dāng)?shù)呐浔龋�避免產(chǎn)生過濃（或過�。┑木�體量。適宜培養(yǎng)基是確保適宜菌體量的保證。
然后通過中間補(bǔ)料來控制，如當(dāng)菌體生長(zhǎng)緩慢、菌濃太稀時(shí)，則可補(bǔ)加一部分磷酸鹽，促進(jìn)生長(zhǎng)，提高菌濃；
但補(bǔ)加過多，則會(huì)使菌體過分生長(zhǎng)，超過臨界濃度，對(duì)產(chǎn)物合成產(chǎn)生抑制作用。
過程補(bǔ)料通過控制碳源的補(bǔ)料速度來控制菌體生長(zhǎng)速度，達(dá)到控制適宜菌體量的目標(biāo)。
3.菌體濃度的檢測(cè)
工業(yè)發(fā)酵罐在發(fā)酵過程中菌體濃度的測(cè)定方法常用的有直接計(jì)數(shù)法、活菌計(jì)數(shù)法（平板菌落計(jì)數(shù)法，cfu/mL）、濁度法、測(cè)定重量法（干重法和濕重法）、測(cè)定細(xì)胞總氮量或總碳量，以及顏色改變單位法（ccu/mL）等。
這些方法各有特點(diǎn)和適用場(chǎng)景，選擇合適的測(cè)定方法對(duì)于準(zhǔn)確評(píng)估菌體濃度至關(guān)重要。以下介紹一下濁度法、干重法、濕度法。
濁度法用于澄清發(fā)酵液中非絲狀菌的菌體濃度的測(cè)定。通常取發(fā)酵420～600nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定光密度（OD）。
吸光度要求控制在0.2～0.8范圍內(nèi)（不同設(shè)備有一定差距），此時(shí)吸光值與細(xì)胞濃度呈線性關(guān)系，對(duì)于不在此范圍內(nèi)發(fā)酵液，需稀釋在此范圍內(nèi)測(cè)量。
干重法測(cè)定時(shí)，取一定體積的發(fā)酵液離心或過濾，洗去濾渣上可溶物質(zhì)后，105℃烘至恒重稱量即得干細(xì)胞重。
對(duì)于不含不溶性固形物的發(fā)酵液重現(xiàn)性好，對(duì)含有不溶性固形物或者油質(zhì)的培養(yǎng)液則難以得到準(zhǔn)確結(jié)果。
濕重法主要指稱取濕菌體質(zhì)量。取一定體積發(fā)酵液，用自然沉降或離心沉降法測(cè)定沉降物的濕體積或濕質(zhì)量，此法只能作為細(xì)胞濃度的粗略估計(jì)。
菌絲形態(tài)的影響及控制  菌體形態(tài)判斷的指標(biāo)主要包括尺寸指標(biāo)、數(shù)量指標(biāo)、形狀指標(biāo)、形態(tài)特征指標(biāo)及質(zhì)地指標(biāo)五個(gè)方面，這些指標(biāo)可用于評(píng)估和量化微生物菌體的形態(tài)特征，對(duì)于了解菌體的生理狀態(tài)和優(yōu)化發(fā)酵過程具有重要意義。
1. 尺寸指標(biāo)：
菌絲長(zhǎng)度：菌絲由分枝處到頂端的長(zhǎng)度。
周長(zhǎng)：菌絲或菌絲球的周邊長(zhǎng)度，對(duì)于形狀不規(guī)則的菌體，此指標(biāo)量化程度為中等。
面積：周長(zhǎng)所圍的面積，同樣對(duì)于形狀不規(guī)則的菌體，量化程度為中等。
直徑：過菌球中心到邊緣兩點(diǎn)間的距離，量化程度為中等。
2. 數(shù)量指標(biāo)：
生物量：?jiǎn)挝惑w積液體培養(yǎng)基中菌絲體干重，量化程度高。
菌球數(shù)：一定體積液體培養(yǎng)基中菌球的數(shù)量，量化程度低，因?yàn)榫�球�?jì)數(shù)較困難，且定義模糊。
菌絲團(tuán)塊：?jiǎn)挝惑w積液體培養(yǎng)基中菌絲團(tuán)的數(shù)量，量化程度低，計(jì)數(shù)困難，定義模糊。
3. 形狀指標(biāo)：
長(zhǎng)軸：菌絲球最長(zhǎng)直徑，量化程度高。
短軸：與長(zhǎng)軸垂直的最大長(zhǎng)度，量化程度高。
面積比：菌球中實(shí)心部分所占總球面積的比率，量化程度低，需要積分計(jì)算，實(shí)心部分界定困難。
4. 形態(tài)特征指標(biāo)：
分枝頻率：絲狀體中的分枝數(shù)量，量化程度中等，局部統(tǒng)計(jì)可行，但總體統(tǒng)計(jì)因菌絲纏繞程度高導(dǎo)致測(cè)定困難。
觸絲長(zhǎng)度：菌球非實(shí)心部分菌絲的長(zhǎng)度，量化程度低，因觸絲數(shù)量多，難以準(zhǔn)確計(jì)量平均長(zhǎng)度。
5. 質(zhì)地指標(biāo)：
緊密度：?jiǎn)挝惑w積菌球中菌絲干重，量化程度低，因?yàn)榫�絲球體積難以準(zhǔn)確測(cè)定，但可通過透光度進(jìn)行宏觀定量。
粗糙度：菌絲球及菌團(tuán)外部的不規(guī)則性，量化程度低，界定模糊，無法直接量化。
這些指標(biāo)有助于對(duì)菌體的形態(tài)進(jìn)行細(xì)致的描述和量化分析，進(jìn)而可以用于監(jiān)測(cè)和控制發(fā)酵過程中菌體的生長(zhǎng)狀態(tài)，優(yōu)化發(fā)酵條件以提高生產(chǎn)效率。
如果這些指標(biāo)都不明顯，那么這個(gè)菌的菌體形態(tài)指標(biāo)就基本用于是否染菌判斷。
如青霉素生產(chǎn)，生產(chǎn)菌生長(zhǎng)一般分為：Ⅰ. 孢子發(fā)芽，Ⅱ. 菌絲增殖，Ⅲ. 菌絲分枝旺盛，出現(xiàn)脂肪顆粒，Ⅳ. 菌絲生長(zhǎng)減緩，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)小氣泡，Ⅴ. 氣泡增大，顆粒消失，產(chǎn)物形成，Ⅵ. 氣泡延伸，菌絲自溶。
菌絲形態(tài)能夠影響青霉素的生產(chǎn)。在長(zhǎng)期的菌株改良中，青霉素產(chǎn)生菌分化為主要呈絲狀生長(zhǎng)和結(jié)球生長(zhǎng)兩種形態(tài)。
前者由于所有菌絲體都能充分和發(fā)酵液中的基質(zhì)及氧接觸，故一般比生產(chǎn)速率高；
后者則由于發(fā)酵液黏度顯著降低，使氣-液兩相間氧的傳遞速率大大提高，從而促進(jìn)更多的菌絲生長(zhǎng)，發(fā)酵罐體積產(chǎn)率甚至高于前者。
在絲狀菌發(fā)酵中，控制菌絲形態(tài)使其保持適當(dāng)?shù)姆种Ш烷L(zhǎng)度，并避免結(jié)球，是獲得高產(chǎn)的關(guān)鍵要素之一；
在球狀菌發(fā)酵中，使菌絲球保持適當(dāng)大小和松緊，并盡量減少游離菌絲的含量，也是充分發(fā)揮其生產(chǎn)能力的關(guān)鍵因素之一。
青霉素生產(chǎn)中，可通過觀察菌絲形態(tài)變化來控制發(fā)酵。
按規(guī)定時(shí)間從發(fā)酵罐中取樣，根據(jù)“鏡檢”中菌絲形態(tài)和代謝變化的指標(biāo)調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度，通過追加糖或補(bǔ)加前體等各種措施來延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，以獲得最多青霉素。
當(dāng)菌絲中空泡擴(kuò)大、增多及延伸，并出現(xiàn)自溶細(xì)胞，表明菌絲趨向衰老，青霉素分泌逐漸停止，菌絲形態(tài)上將要進(jìn)入自溶期。
在菌體自溶期來臨之前，應(yīng)該立刻放罐，將發(fā)酵液迅速進(jìn)行提取操作。  綜合運(yùn)用菌體濃度和形態(tài)控制策略，結(jié)合實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和精確調(diào)整，可以在發(fā)酵工業(yè)中實(shí)現(xiàn)高效生產(chǎn)。對(duì)發(fā)酵過程中菌體濃度和形態(tài)的深入理解，為優(yōu)化生產(chǎn)過程和提高抗生素等發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 

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